亲水相互作用液相色谱(HILIC)虽然不是新技术,但对许多色谱仪不熟悉。Hilic使用与更常见的反相液相色谱(RPLC)相同的移动相和系统。然而,它采用极地固定期来分离潜在有问题的极性分析物并保留带电的化合物,包括无机盐。由于极地分析物已成为环境监测和生物制药开发的重点,因此该技术正在越来越受欢迎。通常,当反相模式显示出足够的分离功率时,通常使用它。Hilic与质谱(MS)高度兼容,并且在使用电喷雾电离(ESI)-MS时很有用。
Hilic柱如何工作?
化学家有各种各样的相反的相位柱和化学物质可供选择。但是,如果使用在RPLC列上保持不当保留的化合物,则Hilic是一个有用的选项,需要对系统或溶剂进行最小化的修改。
Hilic机制是由覆盖固定相颗粒表面的一层薄层驱动的,从而用高度有机流动相形成了分区。极性化合物由氢键和静电相互作用保留,以及固定相。
实际上,Hilic柱能够保留中度至高性极性分析物。洗脱是从极性到大多数极性发生的(与RPLC相反),并且梯度从高度有机化到水。水是HILIC中最强的溶剂,并且更高的缓冲液浓度(通常是甲酸铵或乙酸铵)会增加溶剂强度,改善峰形状,并可以适度地改变选择性。
离子交换通常是Hilic柱上的二次相互作用机制,因为许多极性固定相(包括裸二氧化硅)都是酸性的或碱性的。它可能导致阳离子或阴离子化合物的尾巴和强烈保留。当分析含有阳离子,阴离子和中性化合物的混合物时,电荷中性键相很重要。在方法开发过程中,列的选择至关重要。
(1)极性分析物可以分配进出水层,更多的极性分析物具有更强的相互作用。
(2)带电的极性分析物也可以与二氧化硅表面进行离子交换。
希利克的优势
除了单次运行中保留阳离子,阴离子和极性中性的能力外,HILIC技术还对RPLC提供了替代选择性。高度有机流动相在正模式和负模式下使用MS兼容方法具有增强的灵敏度。
Hilic色谱柱可以具有新颖的Zwitterionis固定相,可提供优越的保留和分离,而没有在较旧的固定相处发现的次级离子交换。也可以使用多羟基果糖(OH5)固定相,可为极化化合物提供Zwitterionic阶段的替代选择性。
下图显示了Agilent Infinitylab Po188bet博金宝官方网站roshell 120 Hilic(Bare Inlica),Agilent Infinitylab Poroshell 120 Hilic-Z(Zwitterionic)和Agilent InfinityLinitylab Poroshell 120 Hilic-OH5(polyhilichoxy Fructan)(多hiloxy Fructan)柱,以显示矫正性分离性分离。水溶性维生素的这种分离表现出使用相同的方法条件在Hilic相之间的选择性差异。可以通过更改方法条件在每一列上优化分离。
洗脱顺序的变化突出了这三列之间选择性的差异,并显示互补的选择性。
Hilic方法开发
在方法开发过程中,应逐一调整参数,以确定所需分离所需的哪些因素。要考虑的参数包括:
•缓冲液浓度 - 高缓冲浓度会增加溶剂强度,从而提高峰形状并稍微改变选择性。较高的缓冲液浓度可能导致LC/MS的离子抑制。
•流动相pH值 - 这会改变化合物的电荷状态及其极性。它可以确定离子交换保留机制是否可以发生,以及在多大程度上。
•色谱柱温度 - 较高的温度可以给出较高的峰形状,而降低温度会导致分析物的保留率更长并提高选择性。
InfinityLab解决方案
为了使色谱分离提高效率和可重复性,InfinityLab Poroshell 120列利用表面多孔颗粒进行高分辨率分离。与使用传统的完全多孔颗粒相反,InfinityLab Poroshell 120列可确保较小的粒度分布。这可以使柱颗粒的更多均匀堆积,并使短分析物扩散路径进出多孔层。这些列中的三个是完美设计用于希利克分离的:Infinitylab Poroshell 120 Hilic,Infinitylab Poroshell 120 Hilic-Z和Infinitylab Poroshell 120 Hilic-OH5。
现在,新型的Ag188bet博金宝官方网站ilent InfinityLab停用添加剂使用户能够减少敏感分析物与仪器中金属之间的相互作用,从而消除了代谢组学和极性农药分析的主要障碍。这是一种独特的流动相添加剂,可通过减少与HPLC,UHPLC或LC/MS系统中的分析物相互作用的量来提高仪器的总体灵敏度。
正在进行的创新
在InfinityLab工具箱中添加脱离活酶添加剂是通过Hilic柱优化极地分析物的途中的又一步。创建用于Hilic柱中的表面多孔颗粒使用户能够与Hilic-Z固定相保持高电荷化合物(包括无机盐)。具有替代选择性的极性化合物可以用Hilic-OH5相分离。
与其他色谱柱相反,可以与C18列(通常分离的极性分析物上的C18柱)一起使用HILIC,以获得互补的选择性。Hilic可以在没有离子配对或衍生化的情况下分离这些极性化合物,从而降低实验室成本并改善吞吐量。
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仅用于研究。不用于诊断过程。
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