我们用来评估肽图的指标之一是序列覆盖率。有时,我们实际上只对一些关键肽感兴趣,但是有时候看到整个蛋白质序列很重要。那么,当我们没有100%的序列覆盖范围时,我们该怎么办?
第一步是查看您的数据和蛋白质的序列,以查看缺少多少序列以及未检测到的理论肽。
如下面的第一个示例一样,缺失的单个氨基酸还是很小的二肽或三肽?例如,该序列是否包含连续的赖氨酸残基?通常用于肽映射的反相色谱法不会保留这些物种。
曲妥珠单抗的肽图的序列覆盖率为每个链的98.49%。灰色下划线的氨基酸是未检测到的部分。轻链中缺少单个二肽(HK),而重链中缺少两个二肽(AK和SR)和一个四肽(GQPR)。
在这种情况下,有三个可能的下一步:
- 如果这些残基微不足道,我们可以使用现有数据和肽映射方法前进。
- 如果检测到这些氨基酸至关重要,则有两种可能性:
- 选择一种不同的消化酶,该酶产生不同的切割位点。胰蛋白酶通常是其可预测性的首选蛋白酶,但是那里还有许多其他选择。
- 更改消化方案,目的是通过缩短消化时间来产生不完整的消化。
相关的说明,它是未检测到的小的亲水性肽吗?并非所有C18列都是相同的,有些列会比其他列更具保留性。另一个C18列可能是答案。
缺失的肽是很大还是疏水?例如,曲妥珠单抗中的轻质和重链都有一个互补性决定区域,该区域包括一个非常长的疏水性肽,这可能是具有挑战性的。
在这种情况下,如何恢复这些肽取决于肽丢失的位置。
- 肽可能会粘在其接触的任何表面,包括移液器尖端,样品存储管或自动进样器小瓶。切换供应商或材料可能会有所帮助。
- 重新看一下您的样品准备方案 - 特别是疏水肽会引起沉淀吗?请记住,乙腈崩溃是一种简单而流行的方式,可以使蛋白质从溶液中沉淀出来。
- 如果肽粘在列上,则有几件事可以尝试:
- 您可以进入有机移动阶段的较高百分比吗?还是在您的(可能)乙腈流动相中添加更强的有机溶剂,例如异丙醇?有一个例子如下所示。
- 切换列化学可能是解决方案 - 再次,下次会有更多内容。
- 最后,与肽可能被卡住的地方无关,再回到序列一次。是否缺少乳沟?对消化方案或其他蛋白酶的调整可能会有所帮助。(或者甚至更简单,在搜索数据时是否允许错过分解?也许答案就像复选框一样简单!)
下面的MAB肽图仅具有约75%的序列覆盖范围 - 绝对是一个问题。查看下面的序列,我们看到缺少一些非常大的肽。轻型链中的一个缺失的肽长42个残基,而重链中的另一个缺失是63个氨基酸!平均胰蛋白酶肽仅为6个残基1和方法通常相应地开发。在这种情况下,梯度没有足够高的有机物 - 只有19%的乙腈。
几乎无法分类每一个缺失肽的原因。有时,恢复一个缺失肽的步骤会导致另一个肽丢失,因此需要采取一种方法,例如消化酶的组合。今天,我们确实专注于消化和色谱方法调整,尽管有时可能是另一个C18列的答案。但是希望这种思考的食物有帮助!
直到下一次 -
安妮
参考:
- Giansanti,L。Tsiatsiani,T.Y。Low,A.J.R。哎呀。超出胰蛋白酶以外的六个替代蛋白酶,用于基于质谱的蛋白质组学。自然协议,2016年。
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