方法开发蛋白质分离的提示
现在,Sandeep详细介绍了如何使这些咸手机阶段为HIC,让我们将注意力转向其他方法开发细节。这是我的同事安迪(Andy)将带头的地方。
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蛋白质和mAb的疏水色谱
疏水相互作用色谱(HIC)相当独特,因为它可以根据其疏水性差异分离分子,而它们在本地状态下保持完整。这种独特的功能意味着可以分开任何其他技术难以解决的变体。例如,它可以在翻译后修饰期间可能会在氧化状态,脱氨酸和其他物种中分离变体。
蛋白质HIC最常用的流动相在稀磷酸盐缓冲液中使用高浓度的硫酸铵。缓冲液保持稳定的pH值,硫酸铵确保蛋白质更可能吸附到HIC固定相中,但不太可能沉淀。从高浓度的硫酸铵开始,并进行梯度洗脱至低浓度,可确保按疏水性增加的顺序分子洗脱(以相同的方式逆转相相色谱,RPLC)。
水是粘性的,但是添加改性剂,例如有机溶剂(用于RPLC)或高浓度的硫酸铵(用于HIC)可以进一步提高粘度。这种提高的粘度将导致更高的工作压力,并且由于质量转移减少而可能导致峰值形状差。缓解此问题的最常用工具是在较高的温度下运行HPLC实验。
对于RPLC,较高的温度通常具有预期的效果:随着质量转移的改善,峰变得更加尖锐,并且工作压力降低。通常,分子的保留时间也会减少,但是这种转移通常不是问题的。
但是,在HIC中,升高温度可能会产生有害作用。我们经常看到保留时间和更广泛的峰值而不是更尖锐的峰值和较短的保留时间,从而导致分辨率损失:
实际上,通过降低工作温度来获得更好的分辨率。重要的是要注意,在本实验中使用的温度中等温度(40至45°C),细胞色素c的峰形中的严重恶化。
对于更实际的应用,例如单克隆抗体的氧化变体,可以使用氧化剂迫使降解样品用于方法开发。该方法应谨慎使用,因为选择氧化剂,浓度和暴露时间长度将有很大的变化。典型的单克隆抗体可能包含16个分布在整个分子(重链和轻链)的单独的蛋氨酸残基;其中一些残留物将位于更暴露的区域,因此会更快地做出反应。
NIST MAB的重链和轻链氨基酸序列(RM 8671)
RM 8671 NIST MAB中发现的蛋氨酸残基如图2所示,以粗体突出显示。在红色(重链的FC区域和轻链中的那些)被视为氧化变体。
通过将NIST MAB样品暴露于TERT叔丁基氢氧化物(T-BHP)中,可以看到早期洗脱氧化变体的数量增加:
有关氧化分析的其他信息,请参阅Agilent申请注释188bet博金宝官方网站5994-0199en。
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谢谢,安迪!下次安迪(Andy)将扩大他的方法开发技巧,以测量ADC的药物与抗体比。
关键词:生物柱,液相色谱,疏水相互作用色谱,HIC,方法开发,AdvanceBio博客