QuikChange引物设计程序允许您设计位点定向突变(SDM)的引物，包括单位点和多位点突变项目。该程序根据Stratagene的QuikChange试剂盒引物设计指南和下面描述的规则建议引物序列。

包含错配的引物-模板双工的特征是具有比没有错配的双工更高的自由能。在这个程序中，自由能是用核酸双工的最近邻法计算的。双工DNA中的不匹配被认为是由完全匹配的双工DNA分支组成的内环和/或凸起。引物-模板双工的总自由能是最近邻居的基堆叠能量加上环、凸起和末端“悬空端”的能量的总和。最近邻自由能值取自程序mfold,版本2.3，适于杂交。

当为未翻译DNA的突变设计引物时，包括核苷酸替换、删除或插入，该软件设计足够长度和熔化温度的引物，以合并所需的突变。

当需要蛋白质序列中的氨基酸替换时，该软件选择最节能的碱基变化来生成您选择的氨基酸替换。密码子替换优先考虑需要较少核苷酸替换或导致碱基配对不匹配的密码子(例如G-T)。除了能量守恒规则外，基于Stratagene的简并引物数据，本程序还纳入了若干关于最优密码子替换的经验规则1．

能源成本最小化原则

DNA模板和位点定向突变(SDM)引物之间的双工是不完美的。也就是说，它包含一个或多个碱基错配或单链片段(凸起)。因此，失配双工的自由能高于完美双工，即DNA模板与完全互补寡核苷酸之间的假设双工。不匹配的双工与相应的完美双工的自由能之间的差异被描述为不匹配的“能量成本”。

E0-E1Energy_Cost = ---------- * 100%E0

其中E0是“野生型”双工的自由能，E1是诱变引物-模板双工的自由能。

引物的设计目标是使不匹配引物-模板双工的自由能最小化，从而使能量成本最小化。根据QuikChange引物设计原则，碱基失配必须位于引物的中间区域附近，使引物-模板双工的不稳定区域两侧有更稳定的双工分支。如果需要多个不稳定的碱基错配事件，则引物的侧翼稳定分支更长，以补偿降低的双工稳定性，并将能源成本降至最低。

主要的QuikChange Primer Design程序web界面显示了几个输入控件。我们建议您从上到下填写表单，从选择您正在使用的QuikChange工具包开始。DNA序列(纯文本或FASTA格式)可以通过从本地计算机选择一个序列文件或直接将序列键入或粘贴到所提供的文本区域来输入。

通过选择相应的按钮，该序列既可以作为未翻译的DNA序列上传，也可以作为翻译的蛋白质序列上传。如果需要翻译DNA序列，则可以指定可选的翻译范围。上传后，序列显示为一系列对应于单个聚合物残基的复选框，以允许选择所需的突变位置。对于点突变，使用序列复选框上方的下拉菜单来指定每个所选残基所需的更改类型。对于删除或插入，从点突变下拉菜单下面选择适当的单选按钮。在填写了整个表单并正确设置了所有必要的参数之后，单击将设计任务提交给服务器以进行验证和处理设计引物按钮。结果返回显示引物名称、序列、熔化温度、引物-模板自由能值、能量成本计算和引物-模板双工方案的表格。

通过设计包含多个点突变的单一引物，或创建包含单个突变的多个引物(涉及一个或多个碱基变化的碱基改变或氨基酸替换)，可以将多达七个区域的多个突变引入到未翻译的DNA或蛋白质序列中。当期望的突变相距很远时，后一种方法是可以接受的。它也可以应用于位置紧密的突变，但突变必须在多个步骤中依次执行。

QuikChange引物设计程序可以设计一个引物同时引入几个点突变。例如，两个相邻或间隔少于四个残基的氨基酸可以使用一个引物进行改变，所有必要的碱基改变位于其中间部分和足够长的侧翼分支，以确保双工稳定性和低能量成本。

请注意，如果您的实验需要多个引物，那么程序会自动建议使用QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit，所有相关的自由能都计算为65°C。其他QuikChange套件采用68°C的较高扩展温度。如果在初始参数设置时选择了另一个QuikChange工具包，但该程序设计了多个引物集，则温度将自动更改为65°C，并发出相应的警告。

基地替换

该软件可以设计引物，用一个引物合并多达7个核苷酸替换。

1. 方法，通过粘贴文本或在提供的文本区域中键入文本或定位包含该序列的文件来加载序列浏览按钮。
   
   注:
   • 序列中所有非“a”、“c”、“g”或“t”字符将被忽略。序列中的换行符也会在上传期间删除。
   • 序列可以是FASTA格式，也可以是纯ASCII文本。
2. 按下现在上传按钮。该程序将显示一系列复选框，每个复选框对应于DNA序列中的单个“感觉”核苷酸。
3. 通过选中适当的复选框，选择多达七个要更改的核苷酸。然后，使用复选框区域上方的下拉列表定义新的核苷酸。对于单个核苷酸的变化，请使用最左边的下拉列表(Site 1)。对于两个或两个以上的变化，请从左边开始使用相应的下拉列表。例如，如果期望的突变是59 t - > c而且63 - - - > t然后检查59 t而且63年,一个复选框并选择“c”在最左侧(站点1)下拉列表中选择“t”第二处(站点2)。
4. 新闻设计引物按钮。程序将返回两个表，显示引物特性、序列和引物模板双工方案。

该软件可以设计引物，使用单个引物在DNA序列中产生小的缺失。

1. 方法，通过粘贴文本或在提供的文本区域中键入文本或定位包含该序列的文件来加载序列浏览按钮。
   
   注:
   • 序列中所有非“a”、“c”、“g”或“t”字符将被忽略。序列中的换行符也会在上传期间删除。
   • 序列可以是FASTA格式，也可以是纯ASCII文本。
2. 按下现在上传按钮。该程序将显示一系列复选框，每个复选框对应于DNA序列中的单个“感觉”核苷酸。
3. 检查删除核苷酸或区域复选框上方的单选按钮。
4. 使用复选框，选择两个删除区域两侧的核苷酸如下所示:
   • 序列:acgtgctagctgcacgtacgtagctacgtagcccgatcgtagc…
   • 要删除的区域:cacgta
   • 检查这些基础:…acgtgctagctgcacgtacgtagctacgtagcccgatcgtagc…
   注意:
   • 两个被选中的核苷酸不会被删除
   • 如果你要删除一个核苷酸，你必须检查两个侧翼碱基。
5. 新闻设计引物按钮。该程序将打开两个表，所有引物特征，序列和引物模板双工方案。

注意:这仅适用于QuikChange位点定向突变试剂盒，不适用于QuikChange多位点定向突变试剂盒。

该软件可以设计引物，使用单个引物对DNA序列进行小插入。
注意:目前的软件版本可以很好地进行小插入(最多7个核苷酸)。随着插入时间的延长，长凸起二级结构的自由能对引物-模板双工的自由能有显著的贡献，不建议使用软件设计引物进行长插入。

1. 方法，通过粘贴文本或在提供的文本区域中键入文本或定位包含该序列的文件来加载序列浏览按钮。
   
   注:
   • 序列中所有非“a”、“c”、“g”或“t”字符将被忽略。序列中的换行符也会在上传期间删除。
   • 序列可以是FASTA格式，也可以是纯ASCII文本。
2. 按下现在上传按钮。程序将显示一系列复选框，每个复选框对应序列中的一个“感知”核苷酸。
3. 检查插入两个检查过的核苷酸之间单选按钮，输入要插入的顺序。
4. 使用复选框，选择两个插入位点两侧的核苷酸如下图所示。插入将被合并到它们之间:
   • 检查这些基础:…acgtgctagctgcacgtacgtagctacgtagcccgatcgtagc…
   • 要插入的区域:cacgta
   • 产生的序列:acgtgctagctgcacgtacgtagctacgtagcccgatcgtagc…
   注意:
   • 两个被选中的核苷酸必须彼此相邻
   • 检查标签左边的单选按钮:“插入两个被选中的核苷酸之间”。
5. 新闻设计引物按钮。该程序将打开两个表，所有引物特征，序列和引物模板双工方案。

遗传密码表

DNA翻译的普遍规律如下表所示。请注意，不同的生物有不同的密码子偏好，这可以在特定物种的密码子使用表中找到。本程序推荐的引物针对特定的克隆主机进行了优化(大肠杆菌)．因此，它们可能不符合基因起源生物的密码子使用偏好。

该程序允许您快速预测最有效的碱基变化，导致所需的氨基酸替代。在这个程序中使用的算法返回所有可能的碱基替换来创建所需的氨基酸，并为每种可能性分配一个分数。这些分数是由必须改变的核苷酸数量以及改变是否会导致碱基配对的错配(例如G/T)决定的。然后根据使用简并引物的实验中关于密码子偏差的经验数据对这些分数进行调整分数最低的突变被推荐用于你的诱变实验。

该软件可以设计引物，用一个引物产生多达7个氨基酸的替换。

1. 方法，通过粘贴文本或在提供的文本区域中键入文本或定位包含该序列的文件来加载序列浏览按钮。
   
   注:
   • 序列中所有非“a”、“c”、“g”或“t”字符将被忽略。序列中的换行符也会在上传期间删除。
   • 序列可以是FASTA格式，也可以是纯ASCII文本。
2. 如果在DNA序列中没有指定可选的翻译区域，则只进行F1翻译，否则只翻译指定区域的帧1 (F1)。新闻翻译按钮。这将显示许多复选框，每个复选框将对应翻译的DNA序列中的单个氨基酸残基。
3. 选择多达七个氨基酸，你想改变。然后使用复选框区域下方的下拉列表定义目标残基。对于单个氨基酸的变化，使用最左边的下拉列表;对于两个或多个更改，从左侧开始使用相应的下拉列表。例如，如果想要的突变是25 a - > R而且27 M t - >那你就得检查一下25一个而且27 t复选框，并选择“R (arg)”在最左边的下拉列表和“M(了)”在第二个例子中。
4. 新闻设计引物按钮。该程序将打开两个表，所有引物特征，序列和引物模板双工方案。

氨基酸的删除可以通过使用的协议从DNA序列中删除密码子来执行删除核苷酸．由于可能，这个程序并不特别协助氨基酸的插入遗传密码模糊．因此，我们建议通过使用未翻译的DNA序列和使用明确的密码子来设计氨基酸插入引物。

1.Novoradovsky, A.，et al.(2005)。位点定向突变引物设计的计算原理。2005年NSTI纳米技术会议和贸易展技术论文集，阿纳海姆，2005年，pp. 532-535。

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