Quikchange底漆设计帮助
Quikchange®引物设计程序允许您设计用于定位诱变（SDM）的引物，包括单位点和多个位点诱变项目。该程序根据Stratagene的Quikchange套件底漆设计指南和下面描述的规则建议底漆序列。
包含不匹配的引物双链体的特征是具有比没有不匹配的双链体更高的自由能。在该程序中，自由能是通过核酸双链体最近的邻居方法计算的。双链体中的不匹配被视为内部环和/或凸起，侧面是完美匹配的双链DNA的分支。引物 - 板双链体的总自由能是最近邻居的基本堆叠能量的总和，以及环，凸起和末端“悬挂端”的能量。最近的邻居自由能值是从程序中获取的mfold，版本2.3，并适合杂交。
当设计用于未翻译DNA的诱因（包括核苷酸取代，缺失或插入）时，软件设计足够长的底漆和熔化温度以结合所需的突变。
当需要蛋白质序列中的氨基酸取代时，该软件会选择节能最大的基础变化以生成您选择的氨基酸取代。对密码子置换的偏好是对密码子的偏好，该密码子需要更少的核苷酸取代或结果不匹配的基础配对（例如G-T）。除了节能规则外，基于Stratagene的数据，还将有关最佳密码子更换的几项经验规则纳入该程序1。
最小化能源成本的原则
DNA模板与位置定向诱变（SDM）引物之间的双链体不完美。也就是说，它包含一个或多个基础不匹配或单链段（凸起）。因此，不匹配的双链体的自由能高于完美的双链体，即DNA模板和完美齐解的寡核苷酸之间的假设双链体。不匹配的双链体的自由能和相应的完美双链体之间的差异被描述为不匹配的“能量成本”。
E0-E1energy_cost = ---------- * 100％E0
其中E0是“野生型”双链体和E1的自由能，是诱变引物 - 板双链体的自由能。
底漆的设计旨在最大程度地减少不匹配的引物 - 板双链体的自由能，从而最大程度地减少能源成本。根据Quikchange底漆设计原理，基本不匹配必须位于底漆的中部区域附近，以使引物 - 板双链体的较不稳定区域侧面是更稳定的双工的分支。如果需要多个不稳定的基础底漆事件，则使底漆的侧翼稳定分支更长，以补偿降低的双链体稳定性并最大程度地降低能源成本。
主Quikchange引物设计程序Web界面显示了几个输入控件。我们建议您填写从顶部到底部的表格，从选择您使用的Quikchange套件开始。可以通过从本地计算机中选择序列文件，或直接将序列直接输入或粘贴到提供的文本区域来输入DNA序列（以纯文本或FastA格式）输入。
可以通过选择相应的按钮作为未翻译的DNA序列上载该序列作为未翻译的DNA序列或翻译的蛋白质序列。如果需要DNA序列的翻译，则可以指定可选的翻译范围。上传后，将序列显示为一系列与单个聚合物残基相对应的复选框，以选择所需的突变位置。对于点突变，请使用序列复选框上方的下拉菜单来指定每个选定残基所需的更改类型。对于删除或插入，请从点突变下拉菜单下方选择适当的无线电按钮。填写整个表单并正确设置所有必要的参数后，将设计任务提交到服务器，以进行验证和处理设计引物按钮。返回结果，显示带有引物名称，序列，熔化温度，引物 - 板板自由能值，能量成本计算和引物 - 板双工方案的表。
可以通过设计包含多个点突变的单个引物或创建多个引物，每个突变都可以引入非翻译DNA或蛋白质序列，或者通过产生多个底漆，每种突变都可以引入未翻译的DNA或蛋白质序列，或者通过产生多个引物，每种突变都可以引入多个突变，每个突变都可以引入未翻译的DNA或蛋白质序列。这涉及一个或多个基本变化）。当期望的突变远距离时，后一种方法是可以接受的。它也可以应用于紧密位置的突变，但是诱变必须以多个步骤顺序进行。
Quikchange底漆设计程序可以设计单个底漆，以同时引入多个点突变。例如，可以使用一个底漆在其中部部分和侧翼分支的所有必要的基本变化中更改两个与四个残基相邻或隔开的氨基酸，这些氨基酸足以确保双工稳定性和低能成本。
请注意，如果您的实验需要多个引物，则该程序会自动建议使用Quikchange多站点定向的诱变试剂盒和所有相关的自由能计算为65°C。其他Quikchange套件的较高延长温度为68°C。如果在初始参数设置中选择了另一个Quikchange套件，但是该程序设计了多个引物集，则温度将自动更改为65°C，并发出相应的警告。
基础替换
该软件可以设计引物，以将多达七个核苷酸取代与单个底漆合并。
- 通过粘贴文本或输入提供的文本区域或使用包含序列的文件来加载顺序浏览按钮。
笔记：- 序列中的所有非“ A”，“ C”，“ G”或“ T”字符将被忽略。在上传期间，序列内的线断裂也将删除。
- 该序列可以是FASTA格式或普通ASCII文本。
- 请按立即上传按钮。该程序将显示一系列复选框，每个复选框对应于DNA序列中的单个“ sense”核苷酸。
- 通过检查适当的复选框，选择要更改的最多七个核苷酸。然后，使用复选框区域上方的下拉列表来定义新的核苷酸。对于单个核苷酸变化，请使用最左下的下拉列表（站点1）。对于两个或多个更改，请使用从左侧开始的相应下拉列表。例如，如果所需的突变是59T-> c和63a-> t然后检查59T和63a复选框并选择“C”在最左边的（站点1）下拉列表中，“ T”在第二个（站点2）中。
- 按设计引物按钮。该程序将返回两个表格，显示引物特征，序列和引物 - 板双工方案。
该软件可以设计引物，以使用单个引物在DNA序列中生成小缺失。
- 通过粘贴文本或输入提供的文本区域或使用包含序列的文件来加载顺序浏览按钮。
笔记：- 序列中的所有非“ A”，“ C”，“ G”或“ T”字符将被忽略。在上传期间，序列内的线断裂也将删除。
- 该序列可以是fasta格式或普通ASCII文本的Eather。
- 请按立即上传按钮。该程序将显示一系列复选框，每个复选框对应于DNA序列中的单个“ sense”核苷酸。
- 检查删除核苷酸或区域复选框上方的广播按钮。
- 使用复选框，选择二如下所示，核苷酸立即侧面已删除区域：
- 序列：... acgtgctagctgcacgtacgtagctacgtagccccgatcgtagc ...
- 删除区域：cacgta
- 检查这些基础：... acgtgctagctgcacgtacgtagctacgtacgtagcccgatcgtagc ...
- 两个检查的核苷酸将不会被删除
- 如果要删除单个核苷酸，则必须检查两个侧翼底部。
- 按设计引物按钮。该程序将打开两个具有所有引物特征，序列和引物 - 板双工方案的表。
注意：这仅适用于Quikchange站点定向的诱变试剂盒，不适用于Quikchange多站点定向的诱变试剂盒。
该软件可以设计引物，以使用单个引物生成小插入DNA序列。
笔记：当前的软件版本可与小插入（最多7个核苷酸）一起使用。随着较长的插入，长凸出二级结构的自由能可能会显着有助于引物 - 板双工的自由能，并不建议使用该软件为长时间插入设计底漆。
- 通过粘贴文本或输入提供的文本区域或使用包含序列的文件来加载顺序浏览按钮。
笔记：- 序列中的所有非“ A”，“ C”，“ G”或“ T”字符将被忽略。在上传期间，序列内的线断裂也将删除。
- 该序列可以是fasta格式或普通ASCII文本的Eather。
- 请按立即上传按钮。该程序将显示一系列复选框，每个复选框对应于序列中的单个“ sense”核苷酸。
- 检查在两个检查的核苷酸之间插入广播按钮，然后输入要插入的序列。
- 使用复选框，选择二如下所示，插入位点的核苷酸侧面。它们之间将插入：
- 检查这些基础：... acgtgctagctgcacgtacgtagctacgtacgtagcccgatcgtagc ...
- 要插入的区域：cacgta
- 结果序列：... acgtgctagctgcacgtacgtagctacgtacgtagcccgatcgtagc ...
- 两个检查的核苷酸必须彼此相邻
- 检查标签左侧的单选按钮：“在两个检查核苷酸之间插入”。
- 按设计引物按钮。该程序将打开两个具有所有引物特征，序列和引物 - 板双工方案的表。
遗传代码表
DNA翻译的通用规则如下表所示。请注意，不同的生物具有不同的密码子偏好，可以在物种特定的密码子使用表中找到。该程序推荐的引物针对特定的克隆主机进行了优化（大肠杆菌）。因此，它们可能不符合基因起源的生物体的密码子使用偏好。
| t | C | 一个 | G | |
|---|---|---|---|---|
| t | ttt phe（f） ttc phe（f） tta le（l） TTG Leu（L） |
TCT SE（S） TCC Ser（S） TCA Ser（S） TCG Ser（S） |
tat tyr（y） 塔克·泰尔（y） taa ter（*） 标签术语（*） |
TGT CYS（C） TGC CYS（C） tga ter（*） TGG TRP（W） |
| C | ctt le（l） CTC Leu（L） CTA Leu（L） CTG Leu（L） |
CCT Pro（P） CCC Pro（P） CCA Pro（P） CCG Pro（P） |
猫（H） cac他（h） CAA GLN（Q） CAG GLN（Q） |
CGT ARG（R） CGC ARG（R） CGA ARG（R） CGG arg（r） |
| 一个 | att il（i） ATC ILE（i） ata ile（i） ATG Met（M） |
行为thr（t） ACC THR（T） ACA THR（T） ACG THR（T） |
aat asn（n） AAC ASN（n） AAA LYS（K） aag lys（k） |
agt ser（S） AGC Ser（S） aga arg（r） agg arg（r） |
| G | gtt val（v） GTC Val（V） gta val（v） gtg val（v） |
gct al（a） GCC ALA（A） GCA ALA（A） GCG ALA（A） |
GAT ASP（D） GAC ASP（D） GAA GLU（E） Gag glu（e） |
ggt gly（g） ggc gly（g） gga gly（g） ggg gly（g） |
该程序使您可以快速预测导致所需氨基酸取代的最有效的基础变化。该程序中使用的算法返回所有可能的基本替代品以创建所需的氨基酸并为每种可能性分配得分。这些得分取决于必须改变的核苷酸的数量以及是否导致能够基本配对的不匹配（例如g/t）的变化。然后，根据使用退化引物的实验中的密码子偏差的经验数据对这些分数进行调整。1建议您的诱变实验得分最低的突变。
该软件可以设计引物，以产生多达七个用单个底漆的氨基酸取代。
- 通过粘贴文本或输入提供的文本区域或使用包含序列的文件来加载顺序浏览按钮。
笔记：- 序列中的所有非“ A”，“ C”，“ G”或“ T”字符将被忽略。在上传期间，序列内的线断裂也将删除。
- 该序列可以是fasta格式或普通ASCII文本的Eather。
- 如果您不指定DNA序列中的可选翻译区域，则将执行唯一的F1翻译，否则，将仅翻译指定区域的帧1（F1）。按翻译按钮。这将显示许多复选框，每个复选框将对应于翻译的DNA序列中的单个氨基酸残基。
- 选择要更改的最多七个氨基酸。然后使用复选框区域下方的下拉列表来定义目标残基。对于单个氨基酸更换，请使用最左下的下拉列表；对于两个或多个更改，请使用从左开始的相应下拉列表。例如，如果所需的突变是25a-> r和27T-> m那你必须检查25a和27T复选框，然后选择“ R（arg）”在最左下的下拉列表中“ M（Met）”在第二个。
- 按设计引物按钮。该程序将打开两个具有所有引物特征，序列和引物 - 板双工方案的表。
可以通过使用方案从DNA序列中删除密码子来执行氨基酸的缺失。删除核苷酸。由于可能的遗传密码歧义。因此，我们建议通过使用未翻译的DNA序列并使用明确的密码子进行所需的插入来设计用于氨基酸插入的底漆。
1.Novoradovsky，A。等。（2005）。站点定向诱变的底漆设计的计算原理。2005年NSTI纳米技术会议和贸易展览会的技术论文集，阿纳海姆，2005年，第532-535页。
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