如果有不同的氧化,则如何计算MitoATP的生产率测定介质中的底物(具有不同的P/O比)?
将ATP耦合呼吸(OCR)转换为线粒体ATP生产速率,ADP的化学计量法磷酸化至氧气原子的ATP必须确定在电子传输链的末端减小。不同燃料之间的最大理论P/O值各不相同,并且取决于燃料氧化的化学计量/途径以及效率F1F0 ATP合酶。在标准XF实验条件下,提供了细胞与燃料混合物(主要是葡萄糖,丙酮酸和谷氨酰胺),通常内源性燃料储存(糖原,脂肪酸,其他氨基酸)可用于线粒体氧化。因此,它通过几个细胞系进行了测试并验证P/O值为2.75准确地表示混合物的平均P/O比率外源和内源性氧化底物的。有关更多信息,请参阅白皮书:“使用Agilent Seahorse量化细胞ATP生产率188bet博金宝官方网站XF技术”白皮书量化细胞ATP生产率。
当执行诱导的XF实时ATP速率测定时,如何诱导计算和报告的费率?
在XF实时ATP速率诱导测定期间,诱导的速率显示在该度量的摘要打印输出和平均测定参数计算纸张计算为急性之间所有测量的平均速率注射和寡霉素注射。但是,在每个时间点诱导的费率可以从动力学率数据(测量表)获得。
在XF实时ATP速率测定中定义的XF ATP率指数是什么?
XF ATP速率指数是MitoAtp生产率与GlyCoATP的比率生产率(即MitoAtp速率 /糖型速率)。这个比率代表细胞代谢表型的定量度量。代谢索引更大超过1.0代表细胞代谢,其中大于50%的细胞ATP为从线粒体通过etc/oxphos得出,而索引小于1表明总ATP的50%超过50%是由糖酵解途径产生的。自从代谢指数是比率测量的,它对变化高度敏感或代谢表型的变化。
当单元格时,为什么同一单元格类型的XF ATP速率不同镀以不同的密度?
细胞的代谢表型将受到细胞需求的影响ATP。通常,正在增殖或区分的细胞具有较高的糖酵解速率比汇合(缓慢生长)或末端的细胞分化。要比较实验之间的结果,这是建议在整个研究过程中保持一致的细胞培养条件和细胞播种密度。
为什么必须使用Seahorse XF DMEM培养基,pH 7.4或Seahorse XF XF RPMI培养基,pH 7.4进行测定?
甘油套生产率的计算需要绝对XF实时ATP期间的糖酵解质子外排速率的测量费率分析。要正确计算PER,测定介质必须具有固定的缓冲能力。介质中低浓度的HEPE提供一致的缓冲液在整个测定时间范围内的容量值。虽然添加了HEPES缓冲液略微降低了ECAR信号,它显着提高了质量和ECAR数据的一致性以及转换为PER的准确性(有关更多详细信息,请参见白皮书:改善细胞的定量使用安捷伦Seahorse XF技术的糖酵解188bet博金宝官方网站速率。另外,使用XF DMEM或XF RPMI培养基预先调整为7.4,节省了时间测定准备并确保在XF之间具有一致的测定介质pH值实验。
我可以使用其他Seahorse XF测定媒体运行XF实时ATP速率测定?
准确的甘套效生产率的计算需要使用测定没有苯酚红或碳酸氢盐和低浓度HEPE的培养基缓冲。因此,建议使用安捷伦海马XF DM188bet博金宝官方网站EM(或RPMI),建议使用pH 7.4。与推荐培养基和补充剂的任何偏差(葡萄糖,丙酮酸,谷氨酰胺)将要求缓冲因子应为对每种测定法进行经验确定(使用XF分析仪)(有关更多信息,请参见Seahorse XF缓冲区因子方案)。XF实时ATP速率测定法不能使用任何含有苯酚红的测定介质。
当运行诱导的XF实时ATP速率测定时,OCR之后寡霉素注射高于基础OCR,发生了什么?
添加使电子转运从氧化中取消电子传输的化合物在注射寡霉素之前,磷酸化(例如FCCP,DNP等)通常会导致OCR增加。但是,由于线粒体膜电位降低或没有ATP合酶的参与而消散,因此在这种情况下几乎没有产生ATP。在这些情况下,基底mitoatp生产率无法准确计算。如果脱在一起化合物是怀疑,然后建议包括一个注射的对照组测定中型 +车辆以计算基础MitoATP的生产率。
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