如果所有三个抑制剂仅导致总OCR少降低怎么办?
这三种燃料的氧化以外的其他过程可能会导致基线OCR。这些过程可能会进一步分解为线粒体和非明齿氧气消耗过程:其他线粒体呼吸:呼吸取决于被氧化以支持线粒体呼吸的替代底物。这可能包括(但不限于)短和中链脂肪酸和谷氨酰胺以外的氨基酸。非蒙片剂氧的消耗:细胞中其他生化过程对氧的消耗。这包括(但不限于)非常长的链脂肪酸,它们在过氧化物酶体和其他食用氧气的细胞酶过程中被部分氧化。可以使用Seahorse XF细胞MITO胁迫测试测量总氧气消耗的非线粒体分数。
为什么依赖性报告为零?
如果由于良好的变异性而导致依赖性不高于零或负面,则对该特定底物没有依赖性。如果细胞不依赖于目标燃料途径,则在注射抑制剂后可能会略有增加。发生这种情况时,依赖性将自动设置为零(无依赖性),灵活性将等于容量。
如果我的灵活性值负值,那意味着什么?
当OCR的变化很小时,变化良好可能会导致负灵活性值。低于5%的负灵活性值通常归因于测定中的噪声。如果您检测到明显的负灵活性,请联系技术支持。
我如何进一步诊断或故障排除MITO燃油弹性测试结果?
可以通过执行(作为单独的测试或添加的组)进一步诊断出所述的潜在问题(对抑制剂的明显低反应,0%的依赖性或负灵活性值)可以进一步诊断,而仅对媒体注射(无抑制剂)对MITO燃料弹性测试进行了对确定基线呼吸是否在整个测定过程中发生明显变化。如果在没有抑制剂的情况下,绝对呼吸速率(OCR)在整个测定过程中显着向上或向下趋势,则该测试的参数(相对%依赖,容量和灵活性)将分别被低估或夸张。这取决于任何基线趋势的幅度和方向与增加的抑制剂所引起的变化幅度。为了限制任何向上/向下的基线趋势OCR,请确保对测定的细胞培养和技术参数进行了彻底优化。
这些抑制剂和浓度是否可以与所有细胞一起使用?
是的,该测试在浓度远高于其EC50值的浓度下使用所有三种化合物来抑制哺乳动物细胞。这些值已在许多细胞系和主要分离株中得到验证。尽管大多数细胞类型或细胞系对至少一种抑制剂都有明显的反应,但并非所有细胞都会对所有抑制剂做出反应。如果细胞对特定抑制剂的反应不足,则可能不依赖于该特定的燃料途径(也就是说,它们在用于氧化磷酸化的燃料方面具有灵活性)。
我如何在此测定中解释ECAR和糖酵解?
由于细胞ATP的产生和需求的转移,使用抑制剂的组合可以将ECAR数据的解释与该测试混淆。为了直接测量糖酵解功能,我们建议使用Seahorse XF糖酵解应力测试。
推荐的测定介质不包括脂肪酸,我可以添加吗?
尽管不需要,但可以将长链脂肪酸添加到培养基中。我们建议在测试外源脂肪酸氧化时,建议使用一种长链脂肪酸,例如海马XF棕榈酸盐-BSA粮农组织。注意:只有长链脂肪酸(例如棕榈酸酯)的氧化对Etomoxir的抑制作用敏感。
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