为什么协议要求在介质中添加缓冲区,这会抑制ECAR信号吗?
低浓度的HEPES (5 mM)已被发现可在整个检测时间范围内提供一致的缓冲容量值。虽然这种低浓度的HEPES可能会略微降低原始ECAR信号,但它显著提高了ECAR信号的一致性以及向PER转换的准确性。
CO2引起的介质酸化会影响ECAR测量吗?
由TCA循环产生的CO2引起的介质酸化可以影响ECAR,但其相对贡献在不同类型的细胞中差异很大。通过测量Rot/AA注射前后的OCR,并使用Buffer Factor (BF)和CO2贡献因子(CCF),计算线粒体PER并减去生成糖coper。海马XF糖酵解速率测定报告了来自糖酵解的酸化百分比,作为是否有大量的酸来自二氧化碳的一个简单指标。
如何从线粒体耗氧率计算线粒体酸化?线粒体耗氧率(mitoOCR)和线粒体衍生的酸化(mitoPER)之间存在线性相关,即CO2贡献因子(CCF), mitoOCR /mitoOCR之间的比值,是大多数细胞类型中的常数。在使用Seahorse XF糖酵解速率分析报告生成器进行运行后分析时,使用预先确定的CCF从mitoOCR计算线粒体对酸化的贡献。然而,对于高度氧化的细胞(糖酵解的% PER <50%),我们建议对特定类型的细胞再次确认CCF海马XF CO2贡献因子协议用户指南.有关常数的计算和推导的更多细节,请参阅安捷伦白皮书188bet博金宝官方网站海马XF技术提高细胞糖酵解速率定量XF糖酵解速率测定白皮书.
这个试验能给我哪些信息是基础ECAR所不能提供的?
尽管基础ECAR在大多数情况下是糖酵解的一个很好的定性指标,但它包括来自任何酸源的介质酸化,并且不考虑测定介质的缓冲特性。海马XF糖酵解速率测定法通过减去线粒体酸化源,提供了由于糖酵解引起的细胞外酸化的更精确测量,并以标准单位(pmol/min)报告数据。这些特点使得海马XF糖酵解速率测定法与细胞外乳酸生产测定法高度可比。
我需要自己计算缓冲系数(BF)吗?
如果你使用的是推荐配方,那就不需要。缓冲因子已经预先确定为前面描述的标准XF海马糖酵解速率测定培养基。如果使用具有替代成分的测定介质(底物的不同碱基介质浓度),则缓冲因子应在系统中根据试验方法进行经验测定海马XF缓冲因子协议.
我必须使用不含酚红的培养基吗?为什么?
酚红干扰pH传感器,导致表观pH值低于测定介质的实际pH值。虽然这不会影响原始ECAR值,但为了准确计算PER和糖coper,必须从分析介质中省略酚红。
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